Introdução ao PCR digital

O PCR digital (DPCR) é a tecnologia de PCR de terceira geração desenvolvida após PCR convencional e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Seu princípio central é particionar uma mistura de reação contendo moléculas de ácido nucleico alvo em dezenas de milhares de unidades de micro-reação independentes (como micro-dropletas ou microons), com a amplificação individual de PCR ocorrendo em cada unidade.

Após a conclusão da amplificação, uma detecção de terminal (normalmente de um sinal de fluorescência) é realizada em cada unidade. A presença ou ausência de um sinal determina se essa unidade contém a molécula de ácido nucleico alvo. Ao contar o número de unidades positivas e aplicar as estatísticas de distribuição de Poisson, o número absoluto de cópia do ácido nucleico alvo na amostra original pode ser calculado diretamente.

A vantagem central da PCR digital reside em sua capacidade de quantificação absoluta sem dependência de uma curva padrão, levando a resultados mais precisos e confiáveis. Além disso, ele tem uma tolerância maior aos inibidores e demonstra excelente sensibilidade na detecção de alvos de abundância extremamente baixa, como mutações raras, patógenos rastreadores e DNA tumoral circulante (ctDNA).

Esses recursos permitiram ao DPCR mostrar um tremendo valor de aplicação e potencial na pesquisa em ciências da vida e diagnóstico clínico, incluindo campos como biópsia líquida tumoral, diagnóstico pré-natal não invasivo, detecção de patógenos precisa, análise de expressão gênica, quantificação de componentes transgênicos e a avaliação dos padrões de referência.

Tipos de PCR digital

A PCR digital pode ser amplamente classificada em três tipos principais com base no método de particionamento usado para separar a amostra em muitas unidades de reação individuais:

PCR digital baseado em gotículas

Este método particiona a mistura de PCR em dezenas de milhares de gotículas de água em óleo, cada uma agindo como um micro-reator independente de PCR. As gotículas são geradas usando microfluídicas e depois submetidas a amplificação por PCR. Após a amplificação, as gotículas são analisadas individualmente quanto à fluorescência para determinar partições positivas ou negativas. Essa abordagem oferece um número muito alto de partições e é amplamente utilizada por sua sensibilidade e precisão.

PCR digital baseado em chip

Nesta abordagem, a mistura de PCR é particionada em dezenas de milhares de microchâm das microcâmbias em um chip ou placa microfluídica. Cada poço contém um pequeno volume que atua como uma reação isolada de PCR. Após a amplificação, a imagem de fluorescência ou a digitalização lê o sinal de cada partição. Os sistemas DPCR baseados em ChIP geralmente integram a partição de amostras, amplificação e detecção em um único dispositivo.

Métodos híbridos

Isso inclui tecnologias de unidade de reação baseada em gota e método de varredura baseado em chips que combinam recursos de sistemas baseados em gota e chip. A Rainsure usou esse método. Primeiro, dezenas de milhares de gotículas são geradas usando microfluídicas, então as gotículas são espalhadas em uma única camada em um chip. Após a conclusão da reação de PCR, os sinais de fluorescência são coletados por imagem da mesma maneira que o método baseado em chip.

Cada estratégia de particionamento isola as moléculas de ácido nucleico em compartimentos de reação separados, permitindo que o uso de estatísticas de Poisson quantifique com precisão moléculas de DNA ou RNA alvo contando partições positivas e negativas. A escolha do método de particionamento afeta o número de partições, volume de partição, complexidade do fluxo de trabalho e requisitos de instrumentos.

Estatísticas de Poisson em PCR digital

A distribuição de Poisson é fundamental para a PCR digital porque modela a probabilidade de que qualquer partição contenha zero, uma ou múltiplas moléculas -alvo. Ao considerar essas probabilidades, as estatísticas de Poisson permitem a estimativa precisa do número médio de moléculas alvo por partição. Especificamente, quando o volume médio de cada partição (VP) é conhecido, o modelo de Poisson pode ser aplicado para calcular a concentração absoluta de moléculas de ácido nucleico alvo por unidade de volume.

A visão principal da distribuição de Poisson é que a fração de partições negativas (aquelas sem moléculas -alvo) reflete a probabilidade de moléculas zero em uma partição, o que permite o cálculo da ocupação média (λ) em todas as partições. Essa abordagem corrige a possibilidade de que algumas partições positivas contenham mais de uma molécula, impedindo a subestimação da concentração alvo.

A medição precisa de cada variável - partições positivas, partições totais e volume de partição - é essencial, pois qualquer erro pode afetar diretamente a precisão da determinação da concentração de ácido nucleico. No geral, a distribuição de Poisson fornece a estrutura estatística que transforma os dados de partição positivos/negativos binários em uma quantificação absoluta e altamente precisa das moléculas alvo na PCR digital.

Como calcular cópias/gotículas e cópias/µl em PCR digital?

O número total de cópias da molécula alvo em todas as gotículas válidas de uma amostra é calculada multiplicando as cópias da molécula alvo por gotículas com o número de gotículas válidas. Com base no número conhecido de cópias da molécula alvo por gota (λ) e no volume da gota, as cópias por microlitro também podem ser calculadas.

Formulas for calculate copies/droplet and copies/µL in digital PCR

A concentração de DNA alvo no sangue original de 2 ml é de aproximadamente 35.846 cópias/ml.

Qual é o fluxo de trabalho da série Digital PCR DropDX?

O fluxo de trabalho de PCR digital é simples. Normalmente abrange os seguintes etapas:

1. Preparação da mistura de reação

O fluxo de trabalho de detecção digital de PCR (DPCR) começa com a extração de ácido nucleico da amostra para isolar o DNA ou o RNA. Após a extração, os ácidos nucleicos purificados são misturados com o PCR MasterMix, incluindo iniciadores, sondas fluorescentes, nucleotídeos, enzimas e uma supermix especializada projetada para a formação de gotículas.

2. Carregamento de amostra

3. Geração de gotículas e PCR

4. Leitura de chips e análise de dados

Qual é o fluxo de trabalho da série Digital PCR RS32?

O sistema de PCR digital All-in-One RS32 oferece um fluxo de trabalho totalmente automatizado 'amostra-in, resultado '. Após a preparação simples da amostra e o carregamento da amostra no chip, os usuários precisam definir apenas os parâmetros necessários. Depois que o chip é colocado na máquina RS32, todo o processo de detecção prossegue automaticamente sem nenhuma intervenção manual adicional. Esse processo simplificado elimina a necessidade de etapas práticas durante a análise, alcançando a automação completa da entrada da amostra para a saída de resultado.

Vantagens e limitações do PCR digital

Vantagens:

Vantagem	Descrição
Quantificação absoluta	Conta diretamente as moléculas alvo sem a necessidade de uma curva ou referência padrão, melhorando a confiabilidade.
Alta precisão e reprodutibilidade	Fornece resultados mais precisos e reprodutíveis, especialmente para alvos de baixa abundância e pequenas alterações dobradas.
Sensibilidade superior	Detecta concentrações extremamente baixas de alvos, como mutações raras, patógenos traços e ctDNA.
Alta tolerância aos inibidores	O particionamento reduz o impacto dos inibidores da PCR, permitindo quantificação robusta, mesmo em amostras desafiadoras.
Sem confiança na eficiência da amplificação	Os resultados são menos afetados por variações na eficiência da PCR, levando a quantificação mais precisa.

Desvantagens:

Desvantagem	Descrição
Alcance dinâmico mais estreito	O número limitado de partições restringe a faixa de concentrações de destino que podem ser quantificadas com precisão, geralmente exigindo diluição da amostra para alvos altamente abundantes.
Custo mais alto	Equipamentos e consumíveis para DPCR geralmente são mais caros que os do qPCR.
Menor taxa de transferência	O DPCR normalmente processa menos amostras por execução.
Variedade de kit de reagente limitado	Os kits de reagentes comercializados ainda são limitados em variedade e ainda menos kits obtiveram qualificação para uso em hospitais.
Kits de reagentes não intercambiáveis	Como os métodos de particionamento diferem, os kits de reagentes de diferentes fabricantes de PCR digitais não são intercambiáveis.

Comparação entre PCR digital e qPCR

qPCR é ideal para experimentos de alto rendimento com uma ampla faixa dinâmica e resultados rápidos. É quantitativo, mas normalmente requer curvas ou referências padrão, e sua precisão pode ser afetada pelos inibidores e pela eficiência da PCR.

O DPCR oferece quantificação absoluta sem padrões, se destaca em sensibilidade e precisão para alvos de baixa abundância ou raros e é mais tolerante aos inibidores. A escolha entre qPCR e DPCR depende dos objetivos do experimento, tipo de amostra e sensibilidade necessária.

Tabela comparativa: qPCR vs. DPCR

Recurso/aspecto	PCR em tempo real (qPCR)	PCR digital (DPCR)
Quantificação	Relativo ou absoluto (requer curvas ou referências padrão)	Absoluto (sem padrões ou referências necessárias)
Formato de reação	PCR a granel, volumes de reação flexíveis	Amostra particionamento, volumes de partição fixa
Impacto de eficiência de PCR	Impactado pelas mudanças na eficiência da PCR (dados coletados durante a fase exponencial)	Não afetado por alterações de eficiência de amplificação
Tolerância aos inibidores	Propenso a inibidores	Maior tolerância ao inibidor
Método de detecção	Detecção em tempo real	Detecção de ponto final
Faixa dinâmica	Ampla faixa dinâmica	Alcance dinâmico mais estreito
Sensibilidade	Variação mais alta, menos sensível a alvos raros	Detecta pequenas mudanças e alvos raros, maior sensibilidade
Reprodutibilidade	Moderado, pode ser afetado por vários fatores	Maior reprodutibilidade
Poder estatístico	Mais baixo	Mais alto
Maturidade do protocolo	Protocolos bem estabelecidos	Transição fácil do qPCR, mas protocolos ainda desenvolvendo
Taxa de transferência	Alto	Mais baixo

Comparação entre PCR digital (DPCR) e seqüenciamento de próxima geração (NGS)

O PCR digital (DPCR) e o seqüenciamento de próxima geração (NGS) são tecnologias complementares em biologia molecular e diagnóstico clínico. Em vez de competir, eles são frequentemente usados juntos para maximizar o poder analítico:

O NGS é ideal para uma ampla descoberta, identificando uma ampla gama de variantes genéticas e biomarcadores sem conhecimento prévio de mutações. É fundamental para o DPCR abrangente fornece validação ultrassensível e quantificação precisa de alvos específicos, tornando -o adequado para rastrear mutações conhecidas ou variantes raras ao longo do tempo, especialmente no monitoramento da resposta ao tratamento.

NGS	PCR digital	PCR digital
Limite de detecção	10% -5% para WGs e Wes	0,1%-0,001%
Análise de dados	Suporte bioinformático extenso, exigindo interpretação de dados	Direto
Requisito de conhecimento da mutação	Conhecimento prévio de mutações não necessárias	Obrigatório
Escopo de detecção	Centenas para exoma inteiro ou genoma inteiro	Limitado
Quantificação	Semi-quantitativo	Quantificação absoluta
Tipos de alterações detectadas	Alterações do número de cópias, rearranjos estruturais, SNV ou alterações de metilação em todo o genoma/painéis	Possível em genes/regiões únicas
Tempo de resposta (TAT)	Longo	Curto
Custo	Alto	Baixo

Essas tecnologias são frequentemente integradas nos fluxos de trabalho: NGS para descoberta e criação de perfil, seguidos por DPCR para monitoramento quantitativo e sensível de alvos selecionados. Essa sinergia é particularmente valiosa em medicina de precisão, oncologia, monitoramento de doenças infecciosas e testes genéticos.

Aplicações de PCR digital

Citações

1. Mu H, Zou J, Zhang H. (2024). Detecção quantitativa de mutações T315I de BCR :: ABL1 usando reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais. Célula de hematol transfus ther. 17: S2531-1379 (24) 00030-0. doi: 10.1016/j.htct.2023.12.007.

2. Zhao Z, Wang Y, Kang Y, et al. (2024). Um estudo retrospectivo da detecção de patógenos de sepse comparando a cultura do sangue e a PCR digital independente da cultura. Heliyon. 10 (6): E27523. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e27523.

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4. Chen J, Liu X, Zhang Z, et al. (2024). Marcadores de diagnóstico precoces para carcinoma de células escamosas esofágicas: identificação de genes de alteração do número de cópias e detecção de cfDNA. Investimento de laboratório. 104 (10): 102127. doi: 10.1016/j.labinv.2024.102127.

5. Ele Y, Dong L, Yan W, et al. (2024). Um sistema de PCR multiplex para a detecção e quantificação de quatro eventos de soja geneticamente modificados. Praça de pesquisa. doi: 10.21203/rs.3.rs-4766822/v1.

6. Dong L, Li W, Xu Q, et al. (2023). Um rápido ensaio multiplex de parasitas da malária humana por PCR digital. Clin Chim Acta. 539: 70-78. doi: 10.1016/j.cca.2022.12.001.

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Kit relacionado

Número de gatos	Nome
3.02.03.0001	BCR ABL P210/P190 PCR Digital Teste de Quant Tube
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3.02.01.4074	Human EGFR Gene G719S ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4075	Human EGFR Gene G719A Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4076	Gene EGFR humano E746_A750DELREA (COSM6223) Ensaio de detecção
3.02.01.4077	Gene EGFR humano E746_A750DELREA (COSM6225) Ensaio de detecção
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3.02.01.4079	Human EGFR Gene L747_A750Delinsp (COSM2239) Ensaio de detecção
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3.02.01.4081	Human EGFR Gene S768I Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4082	Human EGFR Gene V769_D770INSASSV Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4083	Human EGFR Gene D770_N771InSG Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4084	Human EGFR Gene T790M Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4085	Gene EGFR humano C797S (COSM6493937) Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4086	Gene EGFR humano C797S (COSM5945664) Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4087	Human EGFR Gene L858R Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4088	Human EGFR Gene L861Q Detecção de mutação
3.02.01.4089	Ensaio de detecção de mutação do gene ESR1 Human Y537S
3.02.01.4090	Ensaio de detecção de mutação do gene D538G humano ESR1
3.02.01.4091	Human Kras Gene G12D Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4092	Ensaio de detecção de mutação KRAS G12V humano

Número de gatos	Nome
3.02.01.4093	Human Kras Gene G12C Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4094	Human Kras Gene G12A Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4095	Human Kras Gene G12S ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4096	Human Kras Gene G13D Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4097	Ensaio de detecção de mutação do gene nRAS humano G12V
3.02.01.4098	Ensaio de detecção de mutação do gene q61r humano NRAS
3.02.01.4099	Human Pik3ca Gene E542K Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4100	Human Pik3ca Gene E545K Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4101	Human Pik3ca Gene H1047R Ensaio de detecção de mutação
3.02.01.4102	Ensaio de detecção de mutação TP53 Human TP53 R175H
3.02.01.4103	Ensaio de detecção de mutação TP53 Human TP53 R248L
3.02.01.4104	Ensaio de detecção de mutação TP53 Human TP53 R273C
3.02.01.4105	Ensaio de detecção de mutação TP53 Human TP53 R273H
3.02.01.4106	Ensaio de detecção de variação do número de cópias do gene HER2 HER2
3.02.01.4108	Influenza humana A Vírus H1N1 -2009 Ensaio de detecção
3.02.01.4109	Ensaio de detecção de vírus H3N2 humano da influenza A H3N2
3.02.01.4113	Ensaio de detecção humano de vírus Epstein-Barr (Bamhi-W)
3.02.01.4114	Ensaio de detecção humano de vírus Epstein-Barr (eBNA1)
3.02.01.4115	Ensaio de detecção de CMV humano
3.02.01.4117	Ensaio de detecção de mutação BCR-ABL Human BCR-ABL T315I
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3.02.01.4122	Ensaio de detecção de mutação IDH1 Human IDH1 R132H
3.02.01.4123	Ensaio de detecção de mutação MyD88 Human MyD88 L265P
3.02.01.4130	Kit de detecção de genes de fusão BCR-ABL (P210) humano (PCR digital)
3.02.01.4138	Ensaio de detecção humano BCR-ABL P190
3.02.01.4265	Kit de detecção SARS-CoV-2 (RT-DPCR)
3.02.01.4277	Kit de detecção de microorganismos patogênicos sepseis (PCR digital)