Em janeiro de 2023, o Laboratório do Ministério da Saúde de Burkina Faso publicou um artigo ' Avaliação comparativa do sistema automatizado de purificação de flexão Kingfisher 96 (Thermofisher Scientific) e Mini-Mini-Kit de RNA Viral Manual para Sars-Cov-2 ' On African Journal of Clinicalology e Miclicalology).

Este estudo explora o estabelecimento de um novo sistema de detecção CoVID-19, usando o kit CoVID-19 sem extração do Rainsure para comparar a eficiência de duas plataformas de extração de ácidos nucleicos, Qiagen e Kingfisher, concentrando-se na detecção molecular rápida da infecção por Covid-19. E como um importante método clínico para detecção de patógenos, para garantir uma triagem rápida e precisa e diagnóstico de pacientes com infecção por Covid-19. Os resultados deste estudo mostram que o método automático de extração do Sistema de Purificação de Flex de Kingfisher 96 (Thermofisher) é menos sensível e específico do que o método de extração manual do kit de RNA viral de Qiaamp (Qiagen).

Título: Avaliação Comparada do Sistema Automatizado de Purificação de Flex de Kingfisher 96 (Thermofisher Scientific) e Manual Mini Kit de RNA Viral RNA (QIAGEN) Métodos de extração para SARS-CoV-2

Jornal: ' Jornal Africano de Microbiologia Clínica e Experimental '

Unidade: Ministério da Saúde de Burkina Faso

Publicado: janeiro de 2023

Plataforma de pesquisa: Rainsure New Coronaria Extração Free Kit

Fundo

A eficiência da extração do ácido nucleico das amostras SARS-CoV-2 afeta diretamente a qualidade dos resultados dos resultados da reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa (RT-PCR), levando a erros no diagnóstico de nova pneumonia coronariana. O objetivo deste estudo transversal foi avaliar o desempenho diagnóstico do sistema de extração automatizado Kingfisher Flex Purification System 96 (termofisher) em comparação com o método de extração manual do kit de Mini RNA viral Qiaamp (Qiagen).

Método

De outubro a dezembro de 2020, foram coletadas espécimes dos suspeitos de casos importados ou contatos de pacientes com coronavírus e 159 amostras de swab nasofaríngeas frescas e 120 amostras de swab nasofaríngeas congeladas congeladas. O kit de detecção CoVID 19 de 1 etapa de 1 etapa do Rainsure FastplextM (RT-PCR, livre de extração de RNA) foi usado para detectar os produtos extraídos pelos dois métodos, e a amplificação por PCR foi concluída no QuantStudio5 Thermal Cycler (Applied Biosystems). A análise do desempenho diagnóstico da detecção SARS-CoV-2 RT-PCR após a extração de RNA pelos dois métodos foi concluída usando o software OpenEPI online (Fig. 1).

Figura 1: Fluxograma de etapas de análise para amostras frescas (a) e congeladas (b)

FastPlexTM Triplex 1-Step COVID 19 Detection Kit (RT-PCR, RNA extraction free) is used to amplify KingFisher Flex Purification System 96 (ThermoFisher) and QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) on the same PCR plate ) two RNAs obtained by two methods, the gene targets of the amplification kit include: ORF1ab (FAM fluorescent dye) and N (HEX corante fluorescente) e referência interna (corante fluorescente Cy5) (Tabela 1).

Tabela 1: Tabela de resultado RT-PCR

Resultados

Para amostras novas, o estudo constatou que a taxa positiva de RT-PCR após a extração manual foi um pouco maior que a da extração automática (12,6% vs 9,4%). Para amostras congeladas, a taxa positiva de extração manual foi muito maior que o método de extração automatizada (38,33% vs 20,83%). Os resultados mostraram que o método de extração automática foi menos eficaz que a extração manual para amostras novas (sensibilidade 35%, especificidade 94,2%) e amostras congeladas (sensibilidade 43,5%, especificidade 93,2%). No entanto, após o teste de McNemar com a correção de Yates, para amostras novas, não houve diferença significativa na taxa positiva de RT-PCR entre os dois métodos de extração (x2 = 0,76, p = 0,38), enquanto houve uma diferença significativa nas amostras congeladas (x2 = 12,9, p = 0,0003).

O estudo constatou que a taxa positiva de RT-PCR de extração manual de amostras frescas (12,6%, 20/159) foi ligeiramente maior que a da extração automática (9,4%, 15/159). Sete amostras (4,4%) foram positivas nas extrações manuais e automatizadas, enquanto 131 amostras (82,4%) foram negativas. Comparado à extração manual, a especificidade da extração automática foi de 94,2%, a sensibilidade foi de 35,0%, o PPV de amostras frescas foi de 46,7%e o NPV foi de 90,9%, mas usando o teste de McNemar com a correção de Yates, não houve diferença entre os dois métodos de extração para novas amostras. Diferença significativa (x2 = 0,76, p = 0,38) (Tabela 2a).

Tabela 2a: Avaliação comparativa dos resultados da RT-PCR após extração automática e manual de amostras frescas

Para amostras congeladas, houve uma diferença significativa na taxa positiva de RT-PCR, entre as quais o método de extração manual foi (38,33%, 46/120), e o método de extração automática foi (20,83%, 25/120) (x2 = 12,9, p = 0,0003). Vinte amostras (16,7%) foram positivas nas extrações manuais e automatizadas, enquanto 69 amostras foram negativas (57,5%). Comparado com a extração manual, a extração automática teve especificidade de 93,24%, sensibilidade de 43,48%, PPV de 80,0%e NPV de 72,63%(Tabela 2B).

Tabela 2b: Avaliação comparativa dos resultados da RT-PCR após extração automática e manual de amostras congeladas

Para amostras frescas, o sistema de extração automática do sistema de purificação Flex Purification 96 (termofisher) em comparação com o método de extração manual de Mini Kit de RNA viral Qiaamp (QIAGEN), as dobras de amplificação dos genes orf1ab e n foram 2,36 e 0,81 vezes, respectivamente, que foi a diferença estatisticamente significativa. No entanto, não houve diferença significativa entre os dois no valor médio da TC do gene n (p = 0,1319). Além disso, não houve diferença significativa entre os valores médios de TC dos genes de referência interna (p = 0,4939) (Tabela 3).

Tabela 3: Valores médios de TC do gene SARS-CoV-2 RT-PCR após extração de amostras frescas e congeladas

Comparado com o método de extração manual do Mini Kit de RNA viral Qiaamp (Qiagen), o sistema de extração automática Kingfisher Flex Purification System 96 (Thermofisher) não tem diferença significativa no valor médio da TC do ORF1AB (p = 0,09885). Da mesma forma, não houve diferença significativa entre os valores médios de TC dos genes N entre os dois extraídos automaticamente (p = 0,0594). Além disso, não houve diferença significativa entre os valores médios de TC dos genes de referência interna (p = 0,1045) (Tabela 3).

Conclusão

Os resultados deste estudo mostraram que o sistema de extração automatizada Sistema de Purificação Flex de Flex de Purificação 96 (Thermofisher) era menos sensível e específico que o método de extração manual de Kit Mini RNA Viral (QIAGEN) Qiaamp. Esses dados podem ser usados como informações de orientação para os laboratórios para escolher métodos de extração de RNA para detecção de RT-PCR de SARS-CoV-2.